本发明涉及一种源于桔绿木霉的内酯衍生物及其应用。该化合物含有一个杂氧原子五环内酯的分子骨架、环上两个甲基处于分子同侧。经实验证实，所述内酯衍生物具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于抗肿瘤的研究。
1.化合物xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="178"/>。
2.权利要求1所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。
3.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。技术领域
本发明涉及一种源于桔绿木霉的内酯衍生物及其应用。
背景技术
近几十年来，在研究和开发新抗肿瘤药过程中，发现了许多具有抗癌活性天然内酯。具有抗癌活性天然内酯大多来源于海洋生物，其结构独特，作用机制新颖，不仅可以提供先导化合物，而且为发现新的作用靶点提供了依据。此外，近几年研究较多的Iejimalidexa0类、前沟藻内酯类、居苔海绵内酯类化合物也为发现新的抗肿瘤作用靶点，开发新作用机制的抗癌药发挥了重要的作用，成为研究新型抗肿瘤药的工具。本发明人研究得知，桔绿木霉（Trichodermaxa0citrinoviride.）IBPT-4xa0(已于2013年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:xa0中国xa0武汉xa0武汉大学，保藏编号是：CCTCCxa0NO：Mxa02013055)xa0的发酵产物的粗提取物有很好的肿瘤细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现其中内酯类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及肿瘤细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种源于桔绿木霉的内酯衍生物及其应用。本发明首先涉及到一株桔绿木霉（Trichodermaxa0citrinoviride.）IBPT-4，该菌株已于2013年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:xa0中国xa0武汉xa0武汉大学，保藏编号是：CCTCCxa0NO：Mxa02013055。所述菌株的用途在于，将桔绿木霉（Trichodermaxa0citrinoviride.）IBPT-4进行发酵培养，菌丝体和发酵液提取物经分离得到具有肿瘤细胞增殖抑制活性的化合物。该化合物结构式为：ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="178"/>。其结构特征是：含有一个杂氧原子五环内酯的分子骨架、环上两个甲基处于分子同侧。本发明还保护了所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途，及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明的显著优点：研究所示含有一个杂氧原子五环内酯的分子骨架结构极为少见，所述内酯衍生物具有显著的抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及肿瘤细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="182"/>xa0xa0xa0xa0。实施例1该化合物的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取桔绿木霉（Trichodermaxa0citrinoviride.）IBPT-4xa0(已于2013年1月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:xa0中国xa0武汉xa0武汉大学，保藏编号是：CCTCCxa0NO：Mxa02013055)xa0适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养4天。取斜面培养4天的桔绿木霉（Trichodermaxa0citrinoviride.）IBPT-4适量，接种到装有400mL培养液xa0[xa0培养液组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH₂PO₄xa00.5xa0，MgSO₄xa00.3，NaCLxa06.0xa0定容xa0]xa0的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。2xa0浸膏的获得用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液与乙酸乙酯1:2（v/v）萃取两次，萃取液减压蒸馏至干，得到发酵液的乙酸乙酯浸膏。菌丝体则以含70%-80%丙酮的水溶液超声破碎3次，除去残渣将清液合并后减压浓缩去除丙酮，按体积比为1:2加入乙酸乙酯萃取两次，减压浓缩至干得菌丝体浸膏。将菌丝体和发酵液浸膏合并后得到提取物总浸膏。3xa0化合物的分离精制xa0该浸膏通过100-200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为洗脱液用减压硅胶色谱柱梯度洗脱。洗脱液经过活性跟踪（对人黑色素瘤细胞株A375抑制），得到活性组分Axa0(二氯甲烷洗脱物)，然后以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱剂，进一步通过加压硅胶柱层析梯度洗脱，得到的活性亚组分A2(二氯甲烷-甲醇为20:1的洗脱物)通过氯仿-甲醇(v/v1:2)为溶剂进行Sephadexxa0LH-20凝胶柱层析，经反相硅胶色谱柱(60%MeOH)除去杂质，最后通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250xa0mm，5μm)：分离流速为5xa0mL/min，流动相为25%乙腈含0.1%xa0TFA，得到所示化合物（9xa0mg，t_Rxa011.6xa0min）。化合物xa0xa0无定型粉末，高分辨质谱HRESI-MS在m/zxa0283.1183处给出分子离子峰[Mxa0–xa0H]^–，(Calcdxa0forxa0C₁₄H₁₉O₆,xa0283.1182)，提示分子量为284，结合波谱信息推测分子式为C₁₄H₂₀O₆。xa0¹H和¹³C-NMR等NMR数据见表1。表1化合物的¹H和¹³C-NMR数据(500xa0MHz，inxa0CDCl₃)^a)ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="555"/>a)xa0本表信号归属基于DEPT、HMQC、NOE及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定。b)xa0xa0此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出耦合相关信号的¹³C核。c)xa0xa0此栏中的数字和代号分别代表在COSY谱中与相应行中的¹H给出耦合相关信号的¹H核。d)xa0xa0此栏中的数字和代号分别代表在NOE谱中与相应的¹H给出耦合相关信号的¹H核。实施例2xa0体外抗肿瘤活性的测试1xa0实验样品及实验方法被测样品溶液的配制xa0xa0测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。细胞系及细胞的继代培养采用人黑色素瘤A375细胞系，A375细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37℃于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法xa0四氮唑盐（MTT）法xa0xa0取对数生长期的人黑色素瘤A375细胞，将细胞密度调至每毫升2×10⁵个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5%xa0CO₂的培养箱中培养4小时。每孔加入2微升样品液或空白溶液，培养24小时后，每孔加MTT液（MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液）10微升，继续培养4小时,37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRAMAXxa0Plusxa0型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值（OD）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IRxa0(%)xa0=xa0(OD_空白对照-OD_样品)/OD_空白对照xa0×xa0100%式计算每个浓度下细胞增殖抑制率xa0(IR%)。2.xa0实验结果细胞增殖抑制活性测试结果在MTT法测试中，根据不同浓度的该化合物的A375细胞增殖抑制率，应用SPSS16.0软件进行数据处理并计算半数抑制浓度IC₅₀值。结果见表2。表2xa0化合物对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制活性ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="553"/>3.xa0结论化合物具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。